Parameter auf einen Blick

Original, Anlysiert, Größenverteilung

Biologischer Hintergrund
Mit der zunehmenden nationalen und internationalen Gesetzgebung zum Schutz des Bodens, werden auch ökotoxikologische Biotests mit Bodenorganismen immer wichtiger. Für den Collembolentest liegt die ISO Norm 11267 „Soil quality - Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants“ (ISO 1999) als internationaler Standard zur Prüfung von Chemikalien vor.
Unter Berücksichtigung einiger Besonderheiten (Fraunhofer 2001b) kann der Test auch hervorragend zur Untersuchung kontaminierter Böden eingesetzt werden. Zu diesem Zweck wurde ein Ringtest erfolgreich durchgeführt (Fraunhofer 2001a). Im Rahmen einer anschließend stattfindenden Vergleichsuntersuchung von 8 unterschiedlich stark belasteten Böden wurden 5 Böden als toxisch für Collembolen beurteilt. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde der Collembolentest in der Teststrategie zur Erfassung der Lebensraumfunktion als einer von 5 Tests vorgeschlagen (Fraunhofer 2001b).

Durchführung des Collembolentests
Die Norm sieht neben einem akuten Tests zur Vorprüfung, einen chronischen 28-Tage-Test als Reproduktionstest vor.
Beim chronischen Test werden zu Testbeginn 10, 10 bis 12 Tage alte Tiere in die Bodenprobe eingesetzt und nach 28 Tagen wird der Test abgebrochen. Zur Auswertung werden die Tiere mit Wasser aufgeschwemmt und dieses Wasser zur besseren Kontrastierung mit Tinte angefärbt. Da tote Collembolen und abgestreifte Häute im Boden sehr schnell ihre hydrophoben Eigenschaften verlieren und von anderen Collembolen als Destruenten auch gefressen werden, werden praktisch nur lebende Tiere aufgeschwemmt. Am Testende müssen bis zu 1000 Collembolen pro Testansatz gezählt werden. Dies kann bei einem durchschnittlichen Test bis zu 20.000 Collembolen bedeuten. Diese werden oft in Doppelzählungen erfasst, da entsprechend der Norm ein Zählfehler von 10 % nicht überschritten werden darf (ISO 1999).

Auswertung mit dem LemnaTec Scanalyzer
Die Auswertung der am Testende mit gefärbtem Wasser aufgeschwemmten Collembolen erfolgt schnell und reproduzierbar mit dem LemnaTec Scanalyzer und dem Softwarepaket Collembol entsprechend der ISO-Norm. Die Software ist für die einfache und effiziente Anwendung in der Laborpraxis ausgelegt. Besondere Computerkenntnisse oder Kenntnisse in der Bildverarbeitung sind nicht erforderlich.
Der Einsatz des LemnaTec Scanalyzers garantiert konstante Aufnahmebedingungen und eine hohe Qualität der Aufnahmen. Dazu wird eine hochauflösende Kamera mit einer Auflösung von 1280 * 960 Pixeln eingesetzt. Der Einsatz niedriger auflösender Kameras ist möglich; es muss dann nur die Aufnahmefläche entsprechend reduziert werden.
Mit der hohen Kameraauflösung können die Collembolen in Gefäßen mit einer Größe bis zu 10,5 * 8 cm aufgeschwemmt und dann automatisch gezählt werden. Durch die Verwendung kleinerer Gefäße steigt die Auflösung und damit wird auch die Differenzierung der Größenverteilung (s. u.) weiter verbessert.

Die Beleuchtung des Scanalyzers ist speziell darauf ausgelegt, konstante Beleuchtungsbedingungen zu gewährleisten, Spiegelungen zu minimieren und bildanalytisch kontrollierbar zu machen.

Auswertungsbeispiel mit Originalbild (Ausschnitt für Gefäß mit der Größe 10,5 * 8 cm) und Auswertungsbild

Mit Hilfe der hochentwickelten Bildverarbeitung lassen sich auch eng aneinanderliegende Collembolen, Schaum und aufgeschwemmte Bodenbestandteile gut separieren und die Collembolen reproduzierbar quantifizieren. Zur effektiven Detektion kleinster Collembolen wird jedoch empfohlen, die Schaumbildung der Proben zu minimieren.
Validierungstests ergaben Abweichungen der automatischen Auswertung vom visuellen Zählwert von deutlich unter 10 %. Damit liegt die automatische Auswertung sicher im Bereich der ISO-Normanforderungen.
Alle Bildanalyseergebnisse werden visuell am Bild dargestellt. Dies ermöglicht eine effiziente Qualitätskontrolle entsprechend GLP. Störobjekte die Bildanalytisch nicht abtrennbar sind (gelegentlich Hefepartikel) lassen sich im Rahmen der Qualitätskontrolle und Nachbearbeitung manuell entfernen. Nachbearbeitung und die visuelle Kontrolle der Ergebnisse werden automatisch protokolliert. Die Bildanalyseparameter können vom Anwender ohne Bildverarbeitungskenntnisse besonderen Bedingungen komfortabel angepasst werden Sollten dennoch Fragen aufkommen, steht LemnaTec gerne zur Verfügung und kann auch Auswertungsmethoden zur Verfügung stellen oder diese Methoden an Kundenbildern optimieren.

Datenhandhabung
Neben Einzelbildern können auch ganze Messreihen nach einmaliger Vorgabe der Konzentrationsstufen und Replikatzahlen und der eingesetzten Konzentrationen eingegeben werden. Zur weiteren Arbeitserleichterung und Verhinderung von Verwechselungen steht optional ein Barcodelesegerät zur Verfügung.
Nach Abschluss der Bildaufnahme werden dann die Bilder des gesamten Tests mit der vorgegebenen Methode vollautomatisch ausgewertet. Alle Daten der Bildaufnahme, Auswertung und die Ergebnisse ganzer Messreihen werden übersichtlich und GLP-konform gespeichert. Alle Bilder, Roh- und Auswertungsdaten stehen für den Export in gängige Tabellenkalkulationsprogramme zur Verfügung.
Für die Auswertung als EC-Werte steht das Statistikmodul Biostat zu Verfügung. Mit diesem GLP-konformen Auswertungsmodul werden nur durch aufrufen der entsprechenden Ergebnisdatei EC-Werte und Vertrauensintervalle berechnet und als Tabelle und Graphik zur Verfügung gestellt.
Neben der Anzahl der Tiere ermittelt der LemnaTec Scanalyzer automatisch auch die Größenverteilung der Collembolen. Damit kann entsprechend den Normvorgaben, die Anzahl der wiedergefundenen Alttiere und die Anzahl der Jungtiere ermittelt werden. Darüber hinaus eröffnet der Scanalyzer aber auch den Zugang zur Größenverteilung der Tiere, als einer wichtigen Populationseigenschaft. Die Größe der Tiere macht auch eine Aussage über die Fitness der Population und deren Reproduktionsdynamik. Dies erleichtert die objektive und reproduzierbare Erfassung „jeglicher pathologischer oder anderer Symptome“, wie dies in der Norm gefordert wird. Die Größenverteilung macht die jeweilige Anzahl und Größe der Tiere aus dem ersten und zweiten Gelege zugänglich und schafft damit neue ökotoxikologische Endpunkte (Krogh 1998).

Größenverteilung einer Kontrollpopulation. Neben den erwachsenen Tieren sind deutlich junge Collembolen aus zwei aufeinanderfolgenden Gelegen zu erkennen.

Da sich aus der Summe der Größe aller Tiere auch ein Gesamtbiomasseparameter ableiten lässt, eröffnet sich die Möglichkeit, neben der Anzahl auch die Gesamtbiomasse (Hier als Summe aller sichtbaren Collembolenoberflächen) zur Berechnung von Hemmwerten als zusätzliche Größe einzusetzen. Unterscheidet sich der EC-Wert der Gesamtcollembolenfläche signifikant von dem der Anzahl, ist dies ein deutlicher Hinweis auf sekundäre Effekte des Schadstoffes, die nicht durch die Anzahl abgebildet werden.
Genaue Untersuchungen zur gebildeten Biomasse und zur Organismengröße sind auch für höher differenzierte Wachstums- und Toxizitätsmodelle, wie z. B. dem DebTox Modell von großer Wichtigkeit (Nisbet 2000, Kooijman 2001)
Bei anderen Tests hat sich eine Verschiebung der Größenverteilung unter Stoffeinfluss und die damit u. U. einhergehende Verringerung der Gesamtbiomasse schon als Toxizitätsparameter herausgestellt. Dieser ist deutlich empfindlicher als die unterschiedslose Zählung aller Organismen (Jenner 1989, LemnaTec 2000, Hammers-Wirtz 2000).
Damit ermöglicht die bildanalytische Auswertung des Collembolentests mit dem LemnaTec Scanalyzer und eine umfassende Quantifizierung von Effekten im Reprotest, sowohl für Forschungszwecke als auch zur Bearbeitung genormter Tests.

Sonderanwendungen bei besonders hoher Auflösung
Die Auflösung der Bilder der einzelnen Collembolen kann durch die Verringerung des Abstandes der Probe zur Kamera und durch einfachen Objektivwechsel für Spezialuntersuchungen noch weiter vergrößert werden. Mehrfachaufnahmen von einer großflächigen Aufnahmeeinheit können bequem als Screening-Messreihen durch Verschieben des Probengefäßes durchgeführt und ausgewertet werden

Beispielbilder bei höheren Auflösungen mit angegebenem Sichtfeld und Auflösung in mm pro Pixel

Literaturangaben