Kurze Programmübersicht

Mit dem LemnaTec Programm ForzaHTS wird die Mobilität von Kleinlebewesen in Mikrotiterplatten quantifiziert.
Die Mikrotiterplatten werden in das LemnaTec Positioniersystem Scanalyzer HTS eingelegt. Nach Start des Aufnahme- und Auswertungsprogrammes wird je nach zu testendem Organismus ein Testprogramm ausgewählt und die entsprechenden Aufnahme- und Analysemethoden automatisch aktiviert. Zur Bildaufnahme werden Mikrotiterplatten über ihren Barcode identifiziert, dann werden die vorgegebenen Bildaufnahmepositionen angefahren.
In der Position nimmt dann das digitale Kamera-System in den vom Anwender bestimmten Zeitabständen eine von ihm festgelegte Anzahl an Bildern auf. Anschließend wird die nächste Aufnahmeposition angefahren. So werden alle Mikrotiterplatten nacheinander eingelesen.
Schon während der Bildaufnahme findet im Hintergrund die Analyse der Bilder statt. Als erstes Bildanalyseergebnis wird aus den Einzelbildern ein Bewegungsbild errechnet und gemeinsam mit einem Originalbild (optional) abgespeichert.
In einem weiteren Analyseschritt werden dann alle signifikanten Bewegungen in den Wells quantifiziert, indem sie in - zuvor konfigurierte - Beweglichkeitsklassen eingeteilt werden.
Damit steht dann zu jeden Well eine Bewegungsverteilung zur Verfügung. Dieses Ergebnis wird gemeinsam mit den Bildern und Rohdaten in die Datenbank eingetragen.
In der Bildübersicht und den Datenausgabetabellen werden auf Basis der Mobilitätsverteilung definierbare Hits farblich besonders markiert. Die diversen Kontrollen werden analog ausgewertet und klassifiziert. Dies erlaubt eine permanente Qualitätskontrolle des gesamten Testsystems.

Abgespeicherte Bilder und Daten

Das Mobilitätsbild enthält in dokumentierter Form alle Bewegungen für die quantitative Analyse und auch spätere Reanalysen. Aus dem optional abspeicherbaren Originalbild lassen sich Auffälligkeiten der Messergebnisse optimal rekonstruieren. Dies bietet ein Maximum an Datenvalidität. So können z. B. auf den Originalbildern die Inokulation mit Eiern, besondere Verfärbungen oder Markierungen für nicht auswertbare Wells detektiert werden.
Neben den Bildern, den Analysemethoden (Aufnahmeanzahl, Zeitdifferenz, Bewegungsklassen) und den Mobilitätsparametern (Mobilitätsklassenverteilung, lebend/beeinflusst/tot Klassifikation) und der Wellidentifikation (Barcode ID, Wellname) werden alle GLP-notwendigen Daten (Zeit, Organismus, Auswerter) gespeichert und stehen für andere Datenbanksysteme zur Verfügung.

Notwendige Auflösung bzw. Ausschnittwahl

Der Anwender legt gemäß den Versuchserfordernissen fest, wie groß der Ausschnitt der Mikrotiterplatte ist, der pro Bild aufgenommen werden soll. Bei Platten mit 96 Wells und den hier vorliegenden Organismen sind Ausschnitte von 4x6 oder 2x3 Wells möglich. Mit kleineren Ausschnitten (2x3 Wells) wächst die Detailauflösung, aber die Aufnahmezeit vervierfacht sich. Zur Veränderung der Auflösung muss nur das Objektiv ausgetauscht und eine andere Konfigurationsdatei verwendet werden.
Die vorliegenden Aufnahmen wurden mit einem 2x3 Ausschnitt aufgenommen.

Aufnahmezeitraum

Wenn sich die untersuchten Organismen sehr schnell bewegen und sich durch Platzmangel in den Wells gegenseitig in Bewegung versetzen, können die Zeitabstände zwischen den Bildaufnahmen und die gesamte Aufnahmezeit kurz gehalten werden, ohne dass es zu einer schlechteren Differenzierung der Bewegungsklassen kommt.
Gleichzeitig kann so der Durchsatz maximiert werden. Ein Aufnahmezeitraum von 5 Sekunden reicht in jedem Fall aus. Bei schnelleren Organismen ist die Verkürzung der Aufnahmezeit auf eine Sekunde möglich.

Ergebnisse der Bilderkennung

Die Mückenlarven auf den Mikrotiterplatten wurden vom MicroMove HTS-Testsystem aufgenommen und den Wells zugewiesen. Die Aufnahmezeiten bei der hier vorgestellten Untersuchung lagen zwischen 1 und 5 Sekunden. Abbildung 1 zeigt jeweils eine Aufnahme aus 5 Sekunden Sequenzen, die als Kontrolle und nach 120 Minuten Testzeit aufgenommen wurden.
Die Aufnahmen zeigen deutliche Größenunterschiede zwischen den einzelnen Testorganismen, da es sich nicht um eine synchronisierte Kultur handelt. Bei Betrachtung der Sequenz fallen weiterhin Unterschiede in der Mobilität der Organismen auf, sowohl bezüglich der Bewegungsgeschwindigkeit als auch der Bewegungshäufigkeit.
Von den Wirkstoffen hervorgerufene Verfärbungen erschweren die differenzierte Betrachtung der Organismen durch menschliche Betrachter besonders im Well 2f (Wirkstoff Nikotin).

Abbildung 1: Originalbilder der Wells. Links Kontrolle 1-6 , rechts 2 Stunden nach Wirkstoffzugabe.
Wirkstoffe in den Wells: 2a: Tensid, 2b: Kontrolle 7, 2c: Kontrolle 8 , 2d: Ethanol 5% , 2e: Ethanol 50%, 2f: Nikotin

Zur Quantifizierung der Bewegungen der Testobjekte wird ein Mobilitätsindex eingeführt. Um das Testsystems von schwer stabilisierbaren Faktoren wie Individuenzahl und -größe zu entkoppeln wird der Index normiert. Die Normierung beruht auf einem mathematischen Bewegungsmodell und berücksichtigt die Anzahl und Größe der Testorganismen. Der Mobilitätsindex ist somit abhängig von der Art der Organismen. Die Schwellenwerte für die Detektion beeinflusster Organismen sind also für jedes Testdesign mit einem Kontrollsatz zu ermitteln und können dann statisch auf beliebig viele Tests innerhalb des Designs angewandt werden.
In Tabelle 1 sind die mit dem LemnaTec MicroMove HTS System ermittelten normierten Mobilitätsindizes aufgeführt. Dabei liegen alle Kontrollen deutlich oberhalb 3000 Einheiten. Im Fall der mit Wirkstoff behandelten Testorganismen werden höchsten Werte von 650 erreicht, was eine deutliche Abschwächung der Bewegung signalisiert. Diese Abschwächung der Beweglichkeit wird bei der Betrachtung der Testsequenz durch einen menschlichen Beobachter ebenfalls wahrgenommen.
Bei längerer Betrachtung der Organismen, die mit Ethanol 50% behandelt wurden, konnten gelegentliche sehr schwache Bewegungen festgestellt werden. Diese werden ebenfalls bei der Ermittlung der Mobilitätsindizes gefunden und mit 62 Einheiten bewertet.

Tabelle 1

Der MicroMove HTS Test detektiert mit hoher Messdynamik die Mobilitäten von Kleinlebewesen. Dabei ist das Testsystem weitgehend unabhängig von der Art, Anzahl und Größe der Individuen, sowie der unterschiedlichen Bewegungsarten der Organismen.

Abbildung 2 zeigt die Falschfarbendarstellung der durch das MicroMove HTS Programm detektierten Bewegungen der Testobjekte. Die Bewegungen wurden in sechs Beweglichkeitsklassen eingeordnet. Zu Testbeginn zeigt jedes Well Ereignisse von der Beweglichkeitsklasse ‚sehr langsam' bis zur Beweglichkeitsklasse ‚sehr schnell', dargestellt in gelb.
Ohne weitere Berechnung lässt sich abschätzen, dass die Bewegungseinstufungen der Wells individuelle Unterschiede aufweisen. Dies liegt hauptsächlich in zwei Faktoren begründet. Zum einen handelt es sich bei den Versuchsobjekten um eine große Anzahl deutlich unterschiedlicher Individuen (siehe Tabelle 1), zum anderen wird eine Bewegung in Richtung der z-Achse (Senkrecht zur Aufnahme) nicht erfasst.

Nach Testende werden in Well a und e (Wirkstoffe Tensid und Ethanol 50%) keine Bewegungen mehr detektiert (siehe Abbildung 1). Wie durch die Betrachtung der Bildsequenz verifizierbar, sind die Testobjekte bewegungslos. Die Kontrollen zeigen nach wie vor Bewegungen aller Klassen.´
Im Well d und f sind die Bewegungen deutlich schwächer geworden (Wirkstoff Ethanol 5% und Nikotin). In Well d (Ethanol) ist die Fläche auf der Bewegungen stattgefunden hat deutlich vermindert. In Well f (Nikotin) werden lediglich noch vereinzelt als ‚normal' klassifizierte Bewegungen erkannt.

Abbildung 2: Falschfarbendarstellung unterschiedlicher Objektbeweglichkeiten (Wells identisch zu Abbildung 1)

Das LemnaTec MicroMove HTS System unterscheidet also auf einer 96 Well Mikrotiterplatte innerhalb von wenigen Sekunden pro Aufnahmeeinheit (2x3 o. 4x6 Wells) zuverlässig tote von lebendigen Testorganismen, ohne dabei von Eintrübungen oder Verfärbungen der Testmedien gestört zu werden. Auch individuelle Unterschiede in der Testpopulation stören den Test nicht.

Statistische Auswertung der Bilderkennung

In Abb. 3 sind die Mobilitätsindizes der Kontrollversuche und des Wirkstofftestes nach 30 min. aufgetragen. Auf Basis der Kontrollversuche lässt sich ein Schwellwert für den Mobilitätsindex von 3000 Einheiten festlegen. Oberhalb dieses Wertes werden Mobilitäten demzufolge als unbeeinflusst deklariert. Die Schwankungen der Mobilitätsindizes der Kontrollen ist auf individuelle Unterschiede der Testorganismen zurückzuführen.

Bild 1: 5 Sekunden Scans von einer Kontrollreihe (links) und einer Testreihe (rechts) nach 30 Minuten mit den auf der X-Achse aufgetragenen Wirkstoffen. Der Schwellenwert für eine detektierbare Wirkung wird basierend auf den Kontrollergebnissen auf 3000 Mobilitätseinheiten festgelegt.

Der Mobilitätswert der mit Ethanol 5% über 30 Minuten behandelten Testpopulation unterschreitet diesen Wert eindeutig, während Nikotin zu einer noch deutlicheren Einschränkung der Mobilität führte. Die mit Ethanol 50% und Tensid behandelten Individuen sind bereits immobil.

Betrachtet man die Bildsequenzen der Wells als Film, so werden diese Ergebnisse der elektronischen Bilderkennung verifizierbar. Auch die leichte Beeinflussung nach 30 min. der mit 5% Ethanol behandelten Testorganismen kann von einem menschlichen Betrachter abgeschätzt werden. Allerdings wären solche Abschätzungen auf keinen Fall für menschliche Betrachter reproduzierbar oder auf Abschätzungen anderer Beobachter übertragbar.

Bild 2: Zeitabhängige Wirkungstoffeffekte auf die Mobilität der Testorganismen

In Bild 2 sind die Wirkstoffeffekte auf die Mobilität der Testorganismen in Zeitabhängigkeit gezeigt. Es wird deutlich, dass die Wirkeffekte von Nikotin und Alkohol nach 30 Minuten noch nicht maximal sind, allerdings unterschreiten diese eindeutig den auf Basis der Kontrollen festgelegten Schwellenwert.
Durch zeitabhängige Messungen können also beispielsweise Wirkprofile von unterschiedlichen Substanzen untersucht und die benötigte Testdauer für eine sichere Unterschreitung des Schwellwertes ermittelt werden.

Zusammenfassung

Mit dem LemnaTec MicroMove HTS lassen sich die untersuchten Testorganismen zuverlässig und effektiv in ihrer Reaktion auf zugesetzte Stoffe klassifizieren. Die Detektionsmethode ist hoch signifikant und ermöglicht dadurch eine rigide Einteilung in Mobilitätsklassen wie es für das HTS-Screening von hoher Bedeutung ist. Störeinflüsse wie Testmedieneintrübungen und Verfärbungen wirken sich nicht merklich auf die Bewegungsanalyse aus. Bereits nach Scans von fünf Sekunden werden valide Daten geliefert, frei von statistischen ‚Dropouts' aufgrund unregelmäßiger, zuckender Bewegungen von aquatischen Kleinlebewesen ohne eindeutige Bewegungsrichtung. Der Test ist damit also weitgehend unabhängig vom Testorganismus. Durch die Normierung des Mobilitätsindexes ist der Test darüber hinaus unsensibel gegenüber einer Varianz der Testorganismenzahl.
Die Ergebnisse liefern weitaus mehr Informationen als lediglich die Unterscheidung der Testpopulationen in lebendigen und toten Organismen. Es lassen sich darüber hinaus geschwächte Organismen sowie eventuell tonisierte erkennen. Durch die Quantifizierung von Mobilitätsklassen können auch Veränderungen im Bewegungsmuster erkannt werden. Durch eine zeitabhängige Messreihe können beispielsweise Wirkprofile untersucht und Testzeitoptimierungen durchgeführt werden. In Kombination mit dem Scanalyzer HTS können bis zu 100 Platten à 96 Wells automatisch ohne Zwischeneingriffe ausgewertet werden.
Die umfassende Dokumentation der Bilder und Daten hält alle Optionen für Reanalysen, Qualitätskontrollen und eine GLP-konforme Dokumentation offen.