Wasserlinse FAQ (lemna spec.)

Wasserlinsen FAQ

Die Wasserlinse allgemein (Lemna spec.)
Was ist eine Wasserlinse (lemna spec.)
Abhängigkeit der G-Werte im Wasserlinsen- und Algentest von der Berechnungsmethode der Hemmwerte und der absoluten Wachstumsrate der Kontrolle
Beobachtungsparameter im Wasserlinsentest
Ermittlung von Hemmwerten beim Wasserlinsentest
Beobachtungsparameter im Wasserlinsentest - Die Farbe der Wasserlinsen
Biotests mit Wasserlinsen zur Feststellung von Bodenkontaminationen
Vergleich der Empfindlichkeit von Algen und Wasserlinsen in Biotests
Wasserlinsen als Biosensoren

Die Wasserlinse Allgemein

Die Wasserlinse (Lemna spec.) kann auf äußere Umwelteinflüsse sehr differenziert reagieren.

Abb.:1 Gesunde Wasserlinse (Lemna gibba)

Die Reaktionen sind dabei sehr unterschiedlich, und ergeben durch Ihre Summe einen wirkstoffspezifischen "Fingerprint"

Neben völliger Entfärbung (Nekrose), die z.B. bei der Zugabe von 4-Nitrophenol auftritt

Abb2.: Nekrotische Lemna gibba nach Zugabe von 4-Nitrophenol

kann es auch zu Formveränderungen kommen. Besonders interessant ist dabei der Einfluß von TNT

Abb 3.: Formveränderung von Lemna gibba unter Einfluss von TNT (r. Aufsicht, l. Seitenansicht)

Die Fronds der Wasserlinse schieben sich zusammen, und heben den Vegetationskörper von der Wasseroberfläche ab. Diese Aufwölbung ist in der Aufsicht als nierenförmiger Frond zu erkennen. In der Seitenansicht sieht man, dass die Blätter sich nach oben schieben.

Ein weitere wirkstoffspezifische Effekte ist das selektive Absterben der Mutterfronds, wobei die neugebildeten Fronds unverändert schnell wachsen. Dieser Effekt tritt besonders stark bei 3,5-Dichlorphenol auf. Der umgekehrte Effekt, also das selektive Absterben von Tochterfronds ist ebenfalls zu beobachten.

Auf CuSO₄ reagiert die Wasserlinse mit der Bildung besonders kleine Fronds. Dieser Effekt ist nach Beendigung der Wirkstoffzugabe reversibel.

4-Nitrophenol: Abbauprodukt von Parathion

TNT: Trinitro-toluol (Sprengstoff)

Frond: Die Funktion der Blätter stimmt morphologisch wahrscheinlich nicht mit den Blättern der Wasserlinse überein. Aus diesem Grund wird die Struktur als "Frond" bezeichnet.

3,5-Dichlorphenol ist ein Atmungskettenhemmer.

Was ist eine Wasserlinse?

Die Wasserlinse ist eine monokotyle, angiosperme Wasserpflanze. Sie gehört in die Unterklasse der Arecidae, wo man sie den Arales zuordnet. Sie steht somit in Verwandtschaft zu Palmen und Aronstabgewächsen. Desweiteren spricht man ihr, wenn auch in geringem Maß, Ähnlichkeiten mit der Ordnung der Poales zu. Zur Ordnung der Poales zählen fast alle Nutzgetreide. Diese Verwandtschaft zeichnet sich durch das Keimen mit nur einem Keimblatt aus. Die Monokotyledoneae sind, wie die Dicotyledoneae, Angiospermae und haben sich phylogenetisch vor ca. 100 Millionen Jahren (obere Kreide) voneinander getrennt. Die Lemnaceae sind fast weltweit verbreitet.

Die Wasserlinse ist gekennzeichnet durch:

Nur ein Keimblatt, das meist scheinbar endständig am Embryo angelegt wird

Eine kurzlebige Hauptwurzel, die frühzeitig durch sproßbürtige Wurzeln ersetzt wird (sekundäre Homorhizie)

Einen kolbenartiger Blütenstand (Spadix)

Rosettenförmigen Wuchs

Das Auslösen der Blühperiode bei langer Lichtexposition (Langtagpflanze)

Weberlin und Schwantes (1979) definieren die Blattstrukturen oder auch Fronds als "... im vorderen Teil einem Blatt, im hinteren einem rückgebildeten Achsenkörper" entsprechend. Rohweder (1983) nennt sie schlicht "Sproßglieder".

In unseren Breiten werden von Lemnaceen fast nie Blüten gebildet. Werden Blüten gebildet, so erfolgt ihre Bestäubung höchstwahrscheinlich durch Fliegen. Die unscheinbaren Früchte werden vom Wasser verbreitet.

Dudley (1981) hat die Zusammensetzung, das Wachstum und die Nutzung von mehreren Lemnaceen Arten untersucht und hat folgende Ergebnisse zusammengetragen:

Lemnaceen werden weltweit von Fischen, höheren Tieren
und auch von Menschen als Nahrung benutzt

Lemnaceen sind die am schnellsten wachsenden höheren Pflanzen weltweit

Lemnaceen enthalten alle essentiellen Aminosäuren

Proteine machen 43% des Trockengewichtes aus

Sie enthalten bis zu 6% Fett und 17% Kohlehydrate

Sie binden signifikante Mengen Stickstoff und Mineralien aus Abwässern

Abhängigkeit der G-Werte im Wasserlinsen- und Algentest von der Berechnungsmethode der Hemmwerte und der absoluten Wachstumsrate der Kontrolle

Matthias Eberius

Der Simulation verschiedener Wasserlinsenteste lag die Frage zugrunde, inwieweit sich der über Biomasseintegral und Biomassezuwachs ermittelte G-Wert ändert, wenn bei konstanter Hemmung der Wachstumsrate (willkürlich gewählter Fixpunkt 20 % Hemmung der Wachstumsrate bei Verdünnungsstufe 512), die absolute Wachstumsrate der Kontrolle und der Steilheit der Konzentrations-Wirkungsbeziehung sich verändert.Die absolute Wachstumsrate der Kontrolle wird in Biotestnormen nur durch Minimalwerte begrenzt, die Steilheit der Konzentrations-Wirkungsbeziehung ist probenspezifisch, also gar nicht normierbar. Um ein Gefühl für die Größe der Effekte für Bioteste mit exponentiellem Wachstum zu bekommen, wurden sowohl typische absolute Wachstumsraten des Algenteste als auch des Wasserlinsenteste eingesetzt. Als Randbedingungen dieser numerischen Simulation wurde strikt exponentielles Wachstum und eine log-lineare Konzentrations-Wirkungsbeziehung der Wachstumsrate angenommen. Derartige annähernd log-lineare Beziehungen wurden bei Wasserlinsen für die Konzentrations-Wirkungsbeziehung der Wachstumsrate öfter beobachtet, das Modell kann aber auch auf eine sigmoide Beziehung erweitert werden. Um die verschiedenen Testszenarien vergleichbar zu machen und möglichst große Bereiche der Konzentrations-Wirkungsbeziehung abzudecken, wurde für eine 20 %ige Hemmung der Wachstumsrate für G = 512 festgelegt, d. h. der G-Wert aller Proben ist 768. Eine 20 %ige Hemmung der Wachstumsrate entspricht je nach absoluter Wachstumsrate der Kontrolle einer 37 bis 44 %igen Hemmung der Endwerte (final biomass). Der hohe G-Wert hat keinen Einfluß auf das zu erzielende Ergebnis, da es dort immer nur relative Differenzen zwischen G-Stufen geht, die unabhängig vom Absolutwert der G-Stufe bzw. der Konzentration immer gleich bleiben. Für die Steilheit der Konzentrations-Wirkungsbeziehung wurden 4 Fälle aus realen Versuchen abstrahiert. So entspricht das Szenario „steil“ der Steigung in einem Test mit Dichlorphenol, „mittel“, einem Test mit Trifluralin, „flach“ einem Test mit Kaliumdichromat und das Szenario „sehr flach“ einem Test mit einer Umweltprobe. Die letzteren Daten wurden freundlicherweise von Frau Vietoris (LUA NW) zur Verfügung gestellt. Bei den Wachstumsraten der Wasserlinsen (Testdauer 7 Tage) wurde der minimale nach OECD valide Wert von 0,275 d^-1, ein mittlerer Wert von 0,325 d^-1 und eine hohe Wachstumsrate von 0,375 d^-1 verwendet. Aus Vergleichsgründen wurden auch Daten für den dreitägigen Algentest mit der minimalen validen absoluten Wachstumsrate 0,9 d^-1 und der hohen aber noch erreichbaren absoluten Wachstumsrate von 1,9 d^-1 mitberechnet. Dies soll nur demonstrieren, daß die hier diskutierte Problematik kein Spezialfall des Wasserlinsenteste ist, sondern genauso beim umfassend genormten und zur Feststellung von G-Stufen häufig eingesetzten Algentest auftreten kann. Die Graphiken dienen der Darstellung der Konzentrations-Wirkungsbeziehungen nach Umrechnung der Verdünnungsstufen in Volumenanteile. In den Tabellen zu jedem Szenario sind jeweils die Felder dick umrandet, die der ersten Verdünnungsstufe entsprechen, bei der die nach der in der ersten Spalte angegebenen Methode und absoluten Wachstumsrate der Kontrolle berechneten Hemmwerte erstmals die 20 % Marke unterschreiten. Die fettgrdruckte Zahl in der Zeile „Rate alle“ ist als Orientierungspunkt der 20 %ige Hemmwert der Wachstumsrate; kursiv/unterstrichen ist der erste Hemmwert der Wachstumsrate, der die 10 % Marke unterschreitet.Die angegebenen Wachstumsrate 0,275, 0,325 und 0,375 beziehen sich auf den Wasserlinsentest mit 7 Tagen, die Werte 0,9 und 1,9 jeweils auf den Algentest mit 3 Tagen Dauer.
Für das Szenario „steil“ gibt es keine G-Wert-Unterschiede zwischen den Berechnungsmethoden und absoluten Wachstumsraten der Kontrolle, die von der absoluten Wachstumsrate oder der Berechnungsmethode abhängig wären.

G-Wert	12288	8192	6144	4096	3072	2048	1536	1024	768	512	384
Rate alle	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	20,1	32,8
Endwert 0,275	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	37,6	54,8
Integral 0,275	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	32,7	49,0
Endwert 0,325	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	40,9	58,6
Integral 0,325	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	35,5	52,2
Endwert 0,375	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	44,2	62,2
Integral 0,375	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	38,3	55,4
Endwert 0,9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	44,9	63,0
Integral 0,9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	40,3	57,7
Endwert 1,9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	68,5	84,8
Integral 1,9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	64,9	81,7

Für das Szenario „mittel“ liegen die aus der Hemmung von Endwert und Integral ermittelten G-Werte für die Wasserlinsen und die niedrige Algenwachstumsrate um eine Stufe, für die hohe absolute Wachstumsrate der Algen schon um 2 Stufen unterhalb der mit der Hemmung der Wachstumsrate ermittelten G-Werte. Die Berechnungsmethode beginnt also, Einfluß auf das Ergebnis auszuüben. Hier zeichnet sich schon bei einem Wert ab, daß das Biomasseintegral trotz strikt exponentiellen Wachstums generell zu etwas niedrigen G-Werten führt als der Biomassezuwachs.Die angegebenen Wachstumsrate 0,275, 0,325 und 0,375 beziehen sich auf den Wasserlinsentest mit 7 Tagen, die Werte 0,9 und 1,9 jeweils auf den Algentest mit 3 Tagen Dauer.

G-Wert	12288	8192	6144	4096	3072	2048	1536	1024	768	512	384
Rate alle	0	0	0	0	0,0	0,0	0,0	5,2	10,8	20,1	25,7
Endwert 0,275	0	0	0	0	0,0	0,0	0,0	11,1	22,0	37,5	45,7
Integral 0,275	0	0	0	0	0,0	0,0	0,0	9,4	18,8	32,7	40,2
Endwert 0,325	0	0	0	0	0,0	0,0	0,0	12,4	24,3	40,8	49,3
Integral 0,325	0	0	0	0	0,0	0,0	0,0	10,4	20,6	35,4	43,3
Endwert 0,375	0	0	0	0	0,0	0,0	0,0	13,7	26,6	44,1	52,9
Integral 0,375	0	0	0	0	0,0	0,0	0,0	11,4	22,5	38,2	46,3
Endwert 0,9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	14,0	27,1	44,8	53,6
Integral 0,9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	12,2	24,0	40,2	48,6
Endwert 1,9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	25,7	46,2	68,3	77,1
Integral 1,9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	23,8	43,2	64,8	73,6

G-Wert	12288	8192	6144	4096	3072	2048	1536	1024	768	512	384
Rate alle	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	2,0	8,9	13,1	20,0	24,3
Endwert 0,275	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	4,4	18,4	26,1	37,5	43,7
Integral 0,275	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	3,7	15,7	22,4	32,6	38,4
Endwert 0,325	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	4,9	20,4	28,7	40,8	47,3
Integral 0,325	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	4,1	17,2	24,5	35,4	41,3
Endwert 0,375	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	5,5	22,4	31,4	44,1	50,8
Integral 0,375	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	4,5	18,9	26,7	38,1	44,4
Endwert 0,9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	5,6	22,9	32,0	44,8	51,5
Integral 0,9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	4,9	20,1	28,3	40,2	46,6
Endwert 1,9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	10,7	39,9	52,8	68,3	75,2
Integral 1,9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	9,9	37,2	49,6	64,7	71,6

G-Wert	12288	8192	6144	4096	3072	2048	1536	1024	768	512	384
Rate alle	1,5	3,8	5,5	7,8	9,5	11,8	13,5	16,0	17,5	20,0	21,5
Endwert 0,275	3,3	8,3	11,7	16,4	19,6	23,9	26,8	31,0	33,5	37,4	39,7
Integral 0,275	2,7	7,0	9,9	13,9	16,7	20,4	23,0	26,8	29,0	32,6	34,7
Endwert 0,325	3,7	9,3	13,1	18,2	21,7	26,3	29,5	34,0	36,6	40,8	43,2
Integral 0,325	3,0	7,7	11,0	15,3	18,3	22,4	25,2	29,2	31,6	35,3	37,5
Endwert 0,375	4,1	10,3	14,5	20,0	23,8	28,8	32,2	37,0	39,7	44,1	46,5
Integral 0,375	3,4	8,5	12,1	16,8	20,1	24,4	27,4	31,7	34,2	38,1	40,4
Endwert 0,9	4,2	10,5	14,8	20,4	24,3	29,4	32,8	37,6	40,4	44,8	47,3
Integral 0,9	3,6	9,2	12,9	18,0	21,4	26,0	29,1	33,5	36,1	40,2	42,5
Endwert 1,9	8,1	19,6	26,9	36,1	42,0	49,3	53,9	60,0	63,4	68,3	70,9
Integral 1,9	7,4	18,2	25,0	33,6	39,2	46,1	50,6	56,6	59,9	64,7	67,4

Die Graphiken dienen der Darstellung der Konzentrations-Wirkungsbeziehungen nach Umrechnung der Verdünnungsstufen in Volumenanteile. In den Tabellen zu jedem Szenario sind jeweils die Felder dick umrandet, die der ersten Verdünnungsstufe entsprechen, bei der die nach der in der ersten Spalte angegebenen Methode und absoluten Wachstumsrate der Kontrolle berechneten Hemmwerte erstmals die 20 % Marke unterschreiten. Die fettgrdruckte Zahl in der Zeile „Rate alle“ ist als Orientierungspunkt der 20 %ige Hemmwert der Wachstumsrate; kursiv/unterstrichen ist der erste Hemmwert der Wachstumsrate, der die 10 % Marke unterschreitet.Die angegebenen Wachstumsrate 0,275, 0,325 und 0,375 beziehen sich auf den Wasserlinsentest mit 7 Tagen, die Werte 0,9 und 1,9 jeweils auf den Algentest mit 3 Tagen Dauer. Zusammenfassung und DiskussionDie durch Normen erlaubten und praktisch möglichen Unterschiede bei den absoluten Wachstumsraten und die Wahl zwischen Biomasseintegral und Zuwachs als Berechnungsgrundlage führen auch in Extremfällen zu maximal 2 G-Stufen Veränderung innerhalb eines Testsystems. Dies kann auf Einleitungserlaubnis und Abwasserabgaben erhebliche Effekte haben, wenn die Berechnungsmethoden und absoluten Wachstumsraten nicht sorgfältig in die Normen integriert werden.Im Extremfall (sehr flache Konzentrations-Wirkungsbeziehung , maximale gegen minimale absolute Wachstumsraten der Kontrollen) führen die Unterschiede der absoluten Wachstumsrate dazu, daß für die gleiche Hemmung der Wachstumsrate 4 G-Stufen „Empfindlichkeitsdifferenz“ zwischen Algen und Wasserlinsen liegen. Direkte Vergleiche der „Empfindlichkeit“ beider Systeme sind folglich auf der Basis von Biomasseintegral und Endwert nicht zulässig. Die Auswertung über die Wachstumsrate setzt dagegen, wenn die Toxizitätseinstufungen konstant bleiben sollen, statt einer 20 %igen Hemmung des Biomasseintegrals eine etwa 8 – 10 %ige Hemmung der Wachstumsrate für Wasserlinsen und eine 4 – 6 %ige Hemmung für Algen voraus. Für die weitere Bewertung der Relevanz dieser Simulation sollten mehr Daten über die Steilheit der Konzentrations-Wirkungsbeziehung für Umweltproben gesammelt und das in der Simulation zugrundegelegte log-lineare Dosis-Wirkungsmodell überprüft und gegebenenfalls optimiert werden. Werden statt G-Werten EC-Werte ermittelt, wächst die sichtbare Differenz zwischen den verschiedenen Wachstumsraten und Auswertungsverfahren wesentlich dramatischer, was die vorgestellten Graphiken und die Zahlenwerte der Tabellen sehr deutlich zeigen. Dementsprechend hoch ist die Brisanz der unterschiedlichen Absolutwerte für die Bewertung nach einem einheitlichen Schema von festgelegten Auslöseschwellen (z. B. EC₅₀als Maßstab für Toxizität). Generell zeigen derartige Simulationen dementsprechend die Wichtigkeit der weitgehenden Normierung von Randbedingungen (Testdauer, absolute Wachstumsraten der Kontrollen) und Auswertungsmethoden zur Ermittlung vergleichbarer Ergebnisse. Wo eine Normierung nur begrenzt (absolute Wachstumsrate der Kontrolle) oder gar nicht (Steilheit der Konzentrations-Wirkungsbeziehung) möglich ist, kann eine Einbeziehung dieser Testparameter in die Auswertungsmethode u. U. weiterhelfen.

Beobachtungsparameter im Wasserlinsentest

Vergleich Frondzahl - Frondfläche - Trockengewicht

Der klassische Wachstumsparameter beim Wasserlinsentest ist die Anzahl aller sichtbaren Fronds (Blätter). Diese läßt sich zwar mit erheblichen Zeitaufwand und begrenzter Reproduzierbarkeit, dafür aber ohne technisches Gerät ermitteln. Nimmt die Zahl der durchgeführten Tests zu und die toxische Hemmung ist gering, wird das manuelle Auszählen der Fronds jedoch bald zum nicht zu unterschätzenden Zeit- und Kostenfaktor. Der Einsatz hochentwickelter Bildauswertungsmethoden ermöglicht die automatische Zählung aller Fronds und eine detaillierte Farbquantifizierung. Gleichzeitig kann durch ein solches System noch die Fläche aller Fronds bestimmt werden. Diese Bestimmung der Frondfläche ist zwar nur mit den Methoden der Bildanalyse möglich, ist dafür aber wesentlich schneller, objektiver und reproduzierbarer meßbar als die Frondzahl.Die Ermittlung der Frondfläche als Beobachtungsparameter hat viele Vorteile für die Testauswertung. Während bei der Frondzählung auch winzige Fronds genauso bewertet werden wie ausgewachsene Mutterfronds, gehen bei der Frondflächenanalyse die Einzelfronds proportional zu ihrer Größe in den Be-obachtungsparameter ein. Dies kommt dem Konzept des Biomasseparameters erheblich näher als die Frondzählung.Sollen die Hemmwerte der Wachstumsrate berechnet und die Testvalidität geprüft werden, so zeigt sich ein weiterer Vorteil der Frondflächenanalyse. Während die Frondfläche praktisch kontinuierlich d.h. mit gleichbleibender Wachstumsrate wächst, nimmt die Frondzahl in den ersten Testtagen mit einer unrealistisch hohen Wachstumsrate zu, sofern der Effekt nicht durch eine Lagphase kompensiert wird. Der Effekt beruht auf einem Testartefakt, da zu Testbeginn nur 3 bis 6 Kolonien mit ausgewachsenen oder zumindest halb ausgewachsenen Fronds eingesetzt werden. Diese schieben dann, durch den Umsetzungsstreß ggf. noch verstärkt, sehr schnell eine große Zahl kleiner Fronds aus den Taschen heraus, was ein extrem hohes Wachstum vortäuscht und aufgrund der kleinen Zahlen außerdem extrem hohe Standardabweichungen erzeugt (Abbildung 1).

Abbildung1: Berechnung der Wachstumsraten für die Frondzahl (a) und die Gesamtfrondfläche (b) für einen 7-tägigen Test mit 5 Parallelen ohne Schadstoffbelastung (Lemna minor, Steinberg Medium).

Nach 2 – 3 Tagen nähert sich die Frondgrößenverteilung dann dem natürlichen Kontinuum an und die Wachstumsrate stabilisiert sich. Dieses Meßartefakt erschwert auch die signifikante Feststellung, ob in der Kontrolle über den gesamten Testzeitraum exponentielles Wachstum herrscht. Außerdem kann es Lagphasen verschleiern und die Werte von Wachstumsraten verzerren.Mit dem LemnaTec Scanalyser werden neben Frondzahl und Gesamtfrondfläche auch die Frondgrößenverteilung ermittelt. Dies liefert wichtige Zusatzinformationen und erklärt auch, warum die Gesamtfrondfläche meist zu niedrigeren EC-Werten führt als die Frondzahl.Viele Schadstoffe führen zu einer Verkleinerung der Fronds. Abbildung 2 zeigt die Konzentrations-Wirkungsbeziehung für Kaliumdichromat mit den Beobachtungsparametern Frondfläche und Frondzahl, aus denen dann jeweils die Hemmung des Biomasseendwertes und die der Wachstumsrate berechnet wurden. Die Hemmung der Frondfläche ist bei gleicher Berechnungsart bis zu 20 % größer als die der Frondzahl, was die typische Verkleinerung der Fronds in Gegenwart von Kaliumdichromat anzeigt.Die hier zusätzlich ermittelten Hemmwerte des Trockengewichts liegen zwischen den Werten für die Anzahl und der Fläche. Dies deutet darauf hin, daß der Schadstoffeinfluß zu einer Kompaktierung der Fronds geführt hat.

Abbldung 2: Auswertung eines Wasserlinsentests mit Kaliumdichromat mit den Beobachtungsparametern Gesamtfrondfläche, Frondanzahl und Trockengewicht. Es wurden jeweils die Hemmwerte über den Endbiomasse und die Wachstumsrate berechnet.Diese Verkleinerung der Fronds spiegelt die Frondgrößenverteilung deutlich wider (Abb. 3). Mit zunehmender Schadstoffkonzentration verlagert sich das Maximum der Größenverteilung hin zu kleineren Größenklassen.

Abbildung 3: Frondgrößenverteilung eines Tests mit Kaliumdichromat in Abhängigkeit von der Konzentration.

Die unterschiedlichen Empfindlichkeiten der Beobachtungsparameter zeigen sich auch deutlich in den ermittelten EC₂₀- und EC₅₀-Werten (Tab. 1). Die höheren EC-Werte, ermittelt auf der Basis der Hemmung der Wachstumsraten, sind eine Folge der Berücksichtigung des exponentiellen Wachstums und der absoluten Wachstumsraten. Die Vorteile der verschiedenen Auswertungsmethoden werden an anderer Stelle ausführlich diskutiert.

Tabelle 1: EC-Werte für einen Test mit Kaliumdichromat in Abhängigkeit vom Beobachtungsparameter und der Auswertungsmethode.

	EC₂₀ [mg/L Kaliumdichromat]		EC₅₀[mg/L Kaliumdichromat]
	Endwert	Wachstumsrate	Endwert	Wachstumsrate
Frondfläche	0,3	0,8	0,9	6,1
Trockengewicht	0,4	1,2	1,7	14,2
Frondzahl	0,5	2,0	2,2	37,0

Die EC-Werte liegen für die Frondzahl in Abhängigkeit von der Auswertungsmethode und des Hemmwertes um den Faktor 1,5 bis 6 höher als bei der Frondfläche. Das Trockengewicht als klassischer Biomasseparameter führt zu mittleren EC-Werten, ist also deutlich weniger empfindlich als die Frondfläche. Dies zeigt erneut, wie der Schadstoffeinfluß zuerst zu einer Kompaktierung der Fronds führt.

Fazit:

Mit Hilfe des LemnaTec Scanalysers lassen sich die Beobachtungsparameter Einzel- und Gesamtfrondfläche objektiv, einfach und zerstörungsfrei messen. In Kombination mit der parallel automatisch ermittelten Frondzahl und der Farbanalyse werden die Wachstumsphänomene normkonform und sehr aussagekräftig abgebildet. Dabei führt der Beobachtungsparameter Frondfläche generell zu gleichen oder niedrigeren EC-Werten als die Frondanzahl und das Trockengewicht. Die OECD-Richtlinie und die DIN-Norm für den Wasserlinsentest berücksichtigen diese bildanalytische Weiterentwicklung der Auswertungstechnik.

Ermittlung von Hemmwerten beim Wasserlinsentest

Für die Auswertung von Wachstumshemmtests mit annähernd exponentiell wachsenden Organismen wie Algen und Wasserlinsen bestehen eine Reihe konkurrierender Auswertungsmethoden. So beschreibt die OECD-Draft „Duckweed growth inhibition test“ in Analogie zum Algentest für mehrfach messbare Beobachtungsparameter die Auswertung nach Endbiomasse, Biomasseintegral und Wachstumsrate. Die ökotoxikologische Aussagekraft und der mathematische Hintergrund der verschiedenen Auswertungsmethoden wurde an anderer Stelle schon umfassend diskutiert. Es wurde für die Berechnung von Hemmwerten der Wachstumsrate gezeigt, dass diese generell niedriger sind, d.h. zu höheren EC-Werten führen, als die Berechnung mit der Endbiomasse. Die Situation wird weiter kompliziert, wenn, wie von der OECD-Richtlinie zum Wasserlinsentest (Entwurf) oder durch die verschiedenen Anforderungsprofile mehrerer Normen gefordert, mehr als ein Parameter ausgewertet werden sollen. In Fällen in denen es zu chemikalienbedingten Frond-verkleinerungen kommt, stellt die Frondfläche gegenüber der Frondzahl den empfindlicheren Parameter dar. Treten Chlorosen auf, verhalten sich Chlorophyllgehalt bzw. bildanalytischer Grünwert noch empfindlicher.

Abbildung 1 : Auswertung eines Wasserlinsentests mit Kaliumdichromat mit den Beobachtungsparametern: Gesamtfrondfläche, Frondanzahl und Trockengewicht. Es wurden jeweils die Hemmwerte über den Endbiomasse und die Wachstumsrate berechnet. Abbildung 1 zeigt eine umfassende Auswertung eines Wasserlinsentests mit Kaliumdichromat, einer häufig verwendeten Referenzchemikalie. Ähnlich flache Konzentrations-Wirkungsbeziehungen werden besonders bei unspezifischen Wirkungen z. B. von Abwasserproben beobachtet. Die wichtige Konsequenz für die praktische Testdurchführung ist, dass es besonders bei flachen Konzentrations-Wirkungsbeziehungen unmöglich ist, mit den 5 als Minimum geforderten Konzentrationsstufen einen statistisch abgesicherten EC₅₀- oder EC_x-Wert für alle Beobachtungsparameter und Berechnungsmethoden zu ermitteln. Sollten gleichzeitig auch NOEC-Werte ermittelt werden, wird die optimale Festlegung der Konzentrationsstufen noch schwerer möglich.
Einerseits soll zwischen den getesteten Konzentrationsstufen maximal der Faktor 2 (OECD) liegen, andererseits sind für eine valide Berechnung mindestens ein, besser jedoch zwei Werte ober- und unterhalb des gewünschten toxikologischen Endpunktes notwendig. Wird dies nicht eingehalten, oder sogar ohne Werte in diesem Bereich des Endpunkts extrapoliert, entstehen häufig Daten mit sehr großem Vertrauensbereich. Derartige Werte sind für legislative Zwecke ungeeignet.

Um die Ergebnisse eines Wasserlinsentests so flexibel zu gestalten, dass damit die Anforderungen verschiedener Auswertungsverfahren bzw. Genehmigungsbehörden, z. B. bei der PSM- und Chemikalienzulassung, mit einem Test erfüllbar sind, ist es deshalb häufig sinnvoll, mehr als 5 Konzentrationsstufen zu testen. Dies erhöht die Zahl der anzusetzenden Proben, verhindert dabei auch die Wiederholung ganzer Testserien, wenn nicht alle Endpunkte ausreichend erfasst wurden.
Die zeitintensive manuelle Datenaufnahme und Testauswertung entfällt zugunsten der sehr zeiteffizienten Bildanalyse. Der Einsatz automatischer Bildauswertungssysteme reduziert so die Kosten zusätzlicher Konzentrationsstufen und bezahlt damit die höhere Stellplatzzahl und längere Zeit zum Ansetzen der Zusatzproben. Damit kann die automatische Bildanalyse sowohl den Zeitaufwand jedes Einzeltests reduzieren und gibt die Sicherheit, einen validen Test durchzuführen. Darüber hinaus dokumentiert die Bildanalyse mit dem LemnaTec Scanalyser ohne Mehraufwand auch weitgehende Quantifizierung aller qualitativen Beobachtungsparameter, die bisher aufwendig und ungenau beschrieben werden mußten. Die Speicherung aller Bilder ermöglicht außerdem eine umfassende Qualitäts-kontrolle und erlaubt spätere Zweitanalysen unter anderen Gesichtspunkten.

Beobachtungsparameter im Wasserlinsentest

Die Farbe der Wasserlinsen

Die Farbe von Pflanzen stellt einen wichtigen Parameter zur Beurteilung des Vitalitätszustandes dar. Deshalb soll neben der Wachstumsgeschwindigkeit, der Frond- und Koloniegröße auch die optischen Beurteilung der Färbung der Pflanzen in die Auswertung des Wasserlinsentests mit einbezogen werden. So zeigen schon hellere Grüntöne der Fronds (Blätter), besonders aber gelb-chlorotische und graubraun-nekrotische Fronds deutlich, daß Stoffe direkt oder indirekt negativ auf das Photosynthesesystem einwirken. Jedoch auch eine Intensivierung des Grüntones, wie sie unter Einsatz niedriger Triazinkonzentrationen auftritt, kann anzeigen, dass die Pflanze versucht, Einwirkungen auf ihr Photosynthesesystem zu kompensieren.Diese graduelle Einstufung der Vitalität durch die Färbung geschieht ohne bildanalytische Systeme auf drei Wegen:ChlorophyllmessungAm Ende eines Tests werden die Wasserlinsen in heißem Ethanol zerkleinert, über Nacht extrahiert, filtriert und dann der Chlorophyllgehalt photometrisch bestimmt. Das mit erheblichem Zusatzaufwand verbundene Verfahren führt bei genauer Einhaltung aller Bedingungen und erfahrenem Personal zu einem reproduzierbaren und empfindlichen Beobachtungsparameter. Da die Messung zerstörend erfolgt, können hier keine Wachstumsreihen erstellt werden. Nur in Kombination mit der Frondfläche können Farbvertiefungen oder Chlorosen von einer Zu- bzw. Abnahme der Bildung von Biomasse unterschieden werden.Qualitative Bemerkungen im VersuchsprotokollWerden nur Frondzahl und/oder die Gesamtfrondfläche ermittelt, so muss der Testanwender entsprechend den Normen jede sichtbare Veränderung der Wasserlinsen qualitativ beschreiben. Die Bewertung ist mit hoher Subjektivität behaftet und erhöht den Zeitaufwand der Protokollierung erheblich. Trotz des hohen Aufwandes können derartige Beobachtungen nicht in die Ermittlungen von G-, EC-, oder NOEC-Werten eingehen und erlauben nur sehr eingeschränkt eine Rekonstruktion der Beobachtungen.Frondklassifizierung Um das gleichwertige Zählen gesunder, geschädigter und toter Fronds zu vermeiden, wurde in amerikanischen Normen festgelegt, daß nur gesunde Fronds und solche mit mindestens 50 % grüner Fläche als lebend, die anderen als tot zu zählen sind. Dies führt jedoch in der Praxis zu einer weiteren Steigerung des Zählaufwandes und zu erheblichen subjektiven Einschätzungstoleranzen.Was leistet der LemnaTec Scanalyser bei der Farbanalyse? Bei der reproduzierbaren Erkennung und quantitativen Klassifizierung von Farben sind Bildanalyseverfahren dem menschlichen Auge weit überlegen. Aus diesem Grund können die aus dem Bild für jedes Pixel ermittelten Farben in eine Reihe von gut überschaubaren Auswertungsdaten überführt werden.Farbklasseneinteilung der Gesamtfrondfläche

Auf der Basis der Pixel aller Fronds werden Farbklassen eingeteilt, z. B. dunkelgrün (gesund), mittelgrün (gesund aber jünger), hellgrün (geschädigt), gelb (chlorotisch), braun + grau (nekrotisch). Damit wird ohne Zusatzaufwand ein objektives quantitatives Bild der Entstehung von Vitalität der Pflanzen in Abhängigkeit von der Zeit oder der Konzentration erzeugt. Abbildung 1a zeigt die Anteile der Farbklassen an der Gesamtfrondfläche für jede Konzentrationsstufe eines Tests mit. Kaliumdichromat. In Abbildung 1b werden alle Flächenanteile auf die Gesamtfrondfläche der Kontrolle bezogen. Die Graphiken zeigen deutlich, die Zunahme an Chlorosen und die Abnahme der Gesamtfrondfläche mit steigender Konzentration des Schadstoffes. Auf der Basis solcher Graphiken lassen sich quantitative Aussagen zur Färbung/Vitalität direkt und objektiv machen und leicht verständlich dokumentieren.
Abbildung 1: Darstellung der Färbungen der Wasserlinsen bei einem Test mit Kaliumdichromat am Testende nach 7 Tagen, relativ zur Gesamtfläche der Kontrolle bestimmt mit dem LemnaTec Scanalyser. Einzelne FrondsDie Farbklassenermittlung kann genauso für jedes Einzelfrond bzw. zweckmäßigerweise für Frondgrößenklassen erfolgen. Dann können die Farbklassen jeweils eines Testansatzes oder die Mittelwerte einer Konzentrationsstufe über die Frondgrößenverteilung dargestellt werden. Dies ergibt eine wichtige, objektiv dokumentierte und grafisch sofort augenfällige Auskunft darüber, ob und wie kleine (junge) bzw. ausgewachsene Fronds geschädigt werden. Bewertende Reports können damit auf sehr klare, gut dokumentierte Vorgaben aus dem Laborprotokoll zurückgreifen. Abbildung 2 zeigt einen Testansatz mit einem Bodeneluat, bei dem am Testende besonders die jungen Fronds und die sehr großen Fronds stark geschädigt waren.

Abbildung 2: Orginalbild, auf Farbklassen reduziertes Bild (drei Grüntöne und Braun für Nekrosen und Chlorosen), und Farbklassen kombiniert mit der Frondgrößenverteilung. Frondklassifizierung Die Klassifizierung aller Fronds z. B. in die ASTM-Kategorien lebend – tot ist problemlos möglich. Dazu müssen nur die prozentualen Anteile der Farbklassen festgelegt werden, die zur jeweiligen Einstufung führen. Ohne Mehraufwand, objektiv und reproduzierbar lassen sich so alle Fronds klassifiziert darstellen und weiter zur Berechnung von Hemmwerten oder z. B. Absterberaten verwenden.

Abbildung. 3: Klassifizierung der Fronds in lebend und tot (mehr als 50 % chlorotisch oder nekrotisch).
FarbanalyseDurch eine sehr differenzierte Farbanalyse und Wichtung aller Farbwerte in Kombination mit einer Korrelationsanalyse gegenüber Chlorophyll kann ein bildanalytischer Grünwert ermittelt werden, der ohne manuellen Zusatzaufwand den Chlorophyllgehalt nachbilden soll. Dies erlaubt eine zerstörungsfreie Messung und die Ermittlung eines in Hemmwerte und EC-Werte umrechnungsfähigen Beobachtungsparameters.

Zusammenfassung: Die Farbe ist ein wichtiger Beobachtungsparameter zur Ermittlung der Vitalität von Wasserlinsen in Biotestsystemen. Der Lemnatec Scanalyser bietet die einzigartige Möglichkeit, diese Farbinformationen effektiv zu quantifizieren und in ökotoxikologisch relevante Kategorien umzusetzen. Leicht erfassbare Ergebnisse der Farbanalysen kombiniert mit einer Messung von Frondanzahl und Frondfläche garantieren eine umfassende, objektive und komfortable Testdokumentation und Auswertung.

Biotests mit Wasserlinsen zur Feststellung von Bodenkontaminationen

Neben den klassischen Einsatzfeldern von Biotests in den Bereichen Chemikalienprüfung und Abwasseruntersuchung wird die Untersuchung von Böden - auch in Rahmen des Bodenschutzgesetzes - zunehmend wichtiger. Hierbei werden auch aquatische Organismen wie Algen, Daphnien und Wasserlinsen, einerseits für die Risikoabschätzung des Wasserpfades andererseits aber auch als empfindliche, gut verfügbare und effektive Detektoren, eingesetzt. Wasserlinsen können in einem breiten pH-Bereich auch auf gefärbten und trüben Eluaten, aber auch auf Feststoffsuspensionen eingesetzt werden. Das macht den Wasserlinsentest wesentlich flexibler als den Algentest. Dies gilt völlig analog auch für die Untersuchung von Sedimenten. Der große Vorteil des Wasserlinsentests gegenüber dem Keimungs- und Wachstumstest mit z. B. Kresse ist das homogene Testmaterial. Alle Wasserlinsenpflanzen sind Klone, während bei Saatgut die Herkunft der Charge, die Samengrößenverteilung als auch die generelle Heterogenität des Erbmaterials zu einer großen Standardabweichung innerhalb der Parallelen beitragen. Vergleiche der Empfindlichkeit verschiedener Biotestsysteme sind generell mit Vorsicht zu betrachten (siehe: Empfindlichkeit von Wasserlinsen - Ein Vergleich, LemnaTec 1999-020). Die vorliegenden Untersuchungen deuten darauf hin, daß keines der Testsysteme Alge, Wasserlinse oder Kresse über alle getesteten Stoffklassen hinweg empfindlicher ist als die anderen. Dies kann man problemlos ü